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本标准规定了斑点叉尾鲫病毒病临床症状、组织病理学特征、病毒分离、中和试验、酶联免疫吸附试
验检测和聚合酶链式反应检测的方法。
本标准适用于斑点叉尾鲷病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
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件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
SC/T 7016.8 鱼类细胞系 第8部分：斑点叉尾蛔卵巢细胞系(CCO)
SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(base pair)
CCO: 斑点叉尾蛔卵巢细胞(channel catfish ovary cell line)
CCV: 斑点叉尾鲫病毒(channel catfish virus)
CCVD: 斑点叉尾卿病毒病(channel catfish virus disease)
CPE: 细胞病变效应(cytopathic effect)
dATP: 脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)
dCTP: 脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)
dGTP: 脱氧鸟苷三磷酸三钠(deoxyaguanosine triphosphate)
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTP: 脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)
dTTP: 脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)
EB:溴化乙啶(ethidium bromide)
EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)
ELISA: 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay)
FBS:胎牛血清(fetal bovine serum)
IgG:免疫球蛋白G(immunoglobulin G)
OD: 光密度(optical delnsity)
OPD: 邻苯二胺(o-phenylenediamine)
PBST: 磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffer solution-tween-20)
PCR: 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
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Taq: 水生栖热菌(thermus aquaticus)
TBE: 三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液(tris-Borate-EDTA)
TCIDso:半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose)
TMB:3,3',5,5'- 四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]
4.1 Taq 酶：5 U/μL。 -20℃ 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。
4.2 dNTP: 含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5 mmol/L,-20℃ 保存。
4.3 无水乙醇：分析纯，使用前预冷到-20℃。
4.13 水：应符合GB/T 6682 中一级水的规格。
4.14 CCV 参考株(阳性对照):由农业部相关部门指定机构提供。
4.15 羊抗CCV 的 IgG 和抗血清：由农业部相关部门指定机构提供。
4.16 鼠抗 CCV 的单克隆抗体：由农业部相关部门指定机构提供。
4.17 斑点叉尾鲫卵巢细胞，应符合SC/T7016.8 的规定，培养液见附录A 中
A.1,细胞消化液见A.2。
4.18 内控 DNA, 是一段长186 bp 的人工合成DNA 片段，其两端的序列和CCV
的引物序列互补。由 检测实验室自己合成，或购买商品化试剂，序列参见附录 B
中 B.1。
4.20 包埋稀释液：pH 9.6,见 A.3。
4.21 PBST:PBS (磷酸盐缓冲液，见 A.4),加入0.05% Tween-20, 见 A.5。
4.22 TMB: 显色液，配方见 A.6。
4.23 底物缓冲液：pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液，见A.7,用于配制显色底物(见
A.8)。
4.24 终止液：2 mol/L 的硫酸，见A.9。
4.25 蛋白酶 K 缓冲液：0.5 mg/mL, 见 A.10。
4.26 TBE 电泳缓冲液：pH 8.0,见 A.11。
4.27 引物：浓度为50 pmol/μL。 引物序列：
F:5'-TCA TCC GAA TCC GAC AAC TGA-3';
R:5'-CCA AGA TCG CGG AGA AAC-3'。
扩增CCV 蛋白激酶基因序列中136 bp 片段。
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参见附录 C。
斑点叉尾鲷。
采样时水温应在20℃以上。采样数量应符合 SC/T7103 的要求。
按GB/T18088 的规定执行。对有临床症状的鱼，体长≤4 cm
的鱼苗，取整条鱼，若是带卵黄囊的 鱼应去掉卵黄囊；体长4 cm～6cm
的鱼苗取内脏(包括肾);体长大于6 cm 的鱼则取肝、肾和脾。对无
症状的鱼取肝、肾和脾；成熟雌鱼还需取卵巢液；鱼卵则取卵膜。
CCV
的分离，无临床症状的成鱼，5尾～15尾为一个样品，有临床症状的成鱼每1尾为1个样品。
先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，按1:10的最终稀释度重悬于含有1000 IU/mL
青霉素和 1000μg/mL 链霉素的培养液中。25℃下孵育2 h～4h,
或4℃下孵育过夜，以释放病毒。8000g 离
心20 min, 收集上清液。
8.2.1
用细胞培养液对1:10的组织匀浆上清液再作2次10倍稀释，然后将1:10,1:100 和
1:1000三个稀释度的上清液分别接种到生长约24 h 的 CCO
单层细胞上(96孔板中),每稀释度至少 2孔，每孔接种100μL。25℃~30℃ 吸 附 1 h
后，不弃去接种液，直接加入100μL 细胞培养液，置于
25℃~30℃培养。试验中要有2孔阳性对照(接种 CCV
参考株),和阴性对照(未接种病毒的细胞)。
8.2.2
阳性对照和待测样品都接种细胞后，用无菌封板膜封盖96孔板。10天内每天用40倍到100倍
倒置显微镜检查。
8.2.3 如果待检样品没有 CPE 出现，则还要盲传一次，然后进行鉴定。
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8.2.4
盲传时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，8000g
4℃离心20 min,
收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，继续置于25℃~30℃培养7天。每天用40倍～100倍
倒置显微镜检查。
在阴性对照细胞始终正常，阳性对照细胞出现了CPE
的情况下，当接种了被检上清稀释液的细胞 出现CPE
时，为病毒分离阳性，需要立即取病毒悬液用下述任意一种方法进行 CCV
鉴定。如果样品经 过接种细胞和盲传后均没有CPE
出现，则结果判断为阴性。如果阳性对照也未出现CPE, 则实验失败。
应换用新的CCO 细胞和一批新的组织样品重新进行病毒分离。
9.1 收集出现CPE 的待检样品病毒液，反复冻融2次后，2000g4℃ 离心15 min
去除细胞碎片。
9.2 将含病毒的上清液系列稀释到10-。
9.3 每稀释度的病毒液与等体积的抗 CCV
抗血清混合，同时另取这些病毒稀释液与等体积的细胞培
养液混合(中和抗血清使用前于56℃灭活30
min,效价按50%蚀斑减少单位计算不少于1:2000)。
9.4
同时，取参考毒株作为阳性对照，取其他病毒株作为阴性对照，按照9.3的方法制备混合液。
9.6 将上述混合物分别接种到生长约24 h 的 CCO
单层细胞上(培养于96孔板中),每稀释度接2孔， 每孔50μL, 于25℃下吸附0.5 h～1
h。
9.7 吸附后每孔加入含有10%胎牛血清的 pH7.3～7.6 的细胞培养液50μL,
于25℃~30℃下培养。
9.9 按照 Reed-Muench 法，计算并比较非中和对照组和中和试验组的 TCID
值。若病毒悬液被抗 CCV 特异性抗血清处理后，CPE
被抑制或被显著推迟，而未被处理的细胞培养液中 CPE 明显，导致二
者病毒滴度相差2个以上，则待测的病毒样品为CCV 中和试验阳性。
10.1 用 pH9.6 的包埋稀释液(见A.3) 适量稀释纯化的羊抗CCVIgG, 包被 ELISA
板，每孔100μL。 4 ℃孵育过夜。
10.2 用 PBST ( 见A.5) 洗 3 次 。
10.3 用1%明胶(溶于PBST 中)封闭，每孔200μL。37℃ 反 应 1 h,用 PBST 洗 3 次
。
10.4 加入待检的样品、CCV 参考毒株(阳性对照)、未接种CCV 的 CCO
悬液(阴性对照)和 PBS (空白 对照),每组设2个平行对照孔，每孔100μL,37℃ 反
应 1 h。 用 PBST 洗 3 次 。
10.5 加鼠抗 CCV 单克隆抗体到小孔中，每孔100μL,37℃ 反 应 1 h。 用 PBST 洗
3 次 。
10.6 加入0 . 1%的 H₂O₂ (用蒸馏水稀释),每孔150μL,37℃ 反应15 min
以便去除非特异性过氧化
物酶。用PBST 洗 2 次 。
10.7 加入标记辣根过氧化物酶的抗鼠 IgG (酶标二抗),每孔100μL,37℃ 反 应 1
h。 用 PBST 洗
10.8 加入底物(底物缓冲液配制的TMB 和过氧化氢，见A.8)。
当阳性对照出现明显蓝色，阴性对照 无色时加入终止液(见 A.9), 在450 nm
波长下读取结果。如果用其他底物(如底物缓冲液配制的 OPD
和过氧化氢)则需改用相应光波长(如490 nm) 测量。
10.9 结果判定。以空白对照的光密度值(即 OD
值)为零，测量各孔的光吸收值。先计算阳性对照和
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阴性对照的 OD 值之比(即P/N 值)。如果P/N≥2.1,
表明对照成立。再计算待测样品孔和阴性对照
孔的P/N 值之比。当 P/N≥2.1 时，判为 CCV ELISA 阳性。
11.1.1 取490 μL 待检样品，加入10 μL 蛋白酶 K 缓冲液(见A.10),56℃ 孵
育 1 h。
11.1.2 加入500μLTris 饱和酚和500 μL 氯仿：异戊醇(24:1),振荡混匀。13000 g
离心10 min。
11.1.3 吸取上层水相，加入新的1.5 mL
的离心管中。注意不要吸到中间层和下层，以免混入蛋白质。
11.1.4 水相中加入不少于1.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后一20℃放置过夜。
11.1.5 13000 g 离心10 min。
11.1.6 弃上清，沉淀在室温下晾至半干，50μL 水溶解， -20℃保存备用。
11.1.7 也可以用采用其他 DNA 抽提方法，或相应的试剂盒来抽提病毒 DNA。
11.2.1 应在单独的工作区进行 PCR 加样工作。每次PCR
检测都应设置阴性对照和阳性对照。
11.2.2 反应体系：10×buffer 10μL、25 mmol/L的 MgSO₄ 10μL、dNTPs(2.5
mmol/L each)4μL、每 条引物(50 pmol/μL)各0.8μL、Taq
酶(5U/μL)0.6μL,内控DNA0.6μL, 模板6μL,加水到总体积为 100μL。 如果PCR
没有热盖，每管还需加入50 μL 矿物油，否则可以不加。短时间低速离心让试剂集
中在底部。再将反应管置于PCR 扩增仪。
11.2.3 反应条件：先93℃4 min, 再93℃30 s,60℃30s,72℃30 s,30
次循环，然后72℃10 min,
最后4℃保温。
用 TBE 电泳缓冲液(见 A.11) 配制3%的琼脂糖(含0.5 μg/mL EB见 A.12)
平板。将10 μL 样品 和2 μL 样品缓冲液(见 A.13)
混匀后加入样品孔。在电泳时设立 DNA 标准分子量作对照。100 mA
恒流电泳，溴酚蓝到达凝胶底部停止电泳。在紫外灯下或者凝胶成像仪中观察核酸带并判断结果。
在11.1样品处理过程中，设立阳性对照、阴性对照和空白对照：
——取含有已知CCV 参考株的细胞悬液作为阳性对照；
— 取未接毒的细胞悬液作为阴性对照；
——取等体积的水代替模板作为空白对照。
11.5.1 内 控DNA 会扩增出186 bp 的 DNA 片段，CCV 病毒 DNA 会扩增出136
bp 的 DNA 片段。
11.5.2 PCR 后，阴性对照和空白对照会出现186 bp 的 DNA
片段，阳性对照会出现186 bp 和136 bp
2 条 DNA 片段。如果对照中CCV 浓度较高，186 bp 的 DNA
片段有可能很弱或消失，此时应该稀释 CCV DNA 浓度后重新试验。
11.5.3 待测样品 PCR 扩增后，能在相应186 bp 和136 bp DNA
位置上有2条带，可判为 PCR 阳性。 仅出现186 bp 的条带，无136 bp
条带或带的大小不是136 bp 判为 PCR 阴性。如果待测样品产生的 DNA
带大小异常或无法准确判断大小，需要将片段进行基因测序，并与已知标准基因序列比较
(参见 B.2)。
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鱼体有临床症状，或组织病理学特征，或接种后的细胞产生CPE,
判定为疑似病例。
符合12.1疑似病例的判定，且中和试验、ELISA、PCR
任何一项检测结果为阳性时，为确诊病例。
若无临床症状和组织病理特征，当接种后的细胞产生了CPE,
且中和试验、ELISA、PCR 任何一项
检测结果为阳性时，则判定为CCV 携带者。
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(规范性附录)
试剂及其配制
A.1 细胞培养液
使用M199(earle's salts)或 DMEM
培养基，按说明书的要求，用一级水配制，然后加入10%经 56 ℃30
min灭活的胎牛血清，用NaHCO₃ 粉末将培养液调pH
为7.2～7.4。过滤除菌，分装后-20℃保
存。在开放系统使用时，需要加入过滤除菌的 HEPES,
使其在培养液中的终浓度为0.02 mol/L。
A.2 细胞消化液(EDTA 0.02%、胰酶0.06%的 PBS 缓冲液)
NaCl
KCl
KH₂PO
Na₂HPO₄ · 12H₂O
EDTA
胰酶 0.6 g
加入 NaHCO₃ (大约0.4 g～0.6 g),调 pH=7.4～8.0(pH\<7.4 时 EDTA
难溶)。充分搅拌直到无
不溶物为止。过滤除菌，分装后-20℃保存。
A.3 包埋稀释液(pH 9.6)
Na₂CO₃
NaHCO₃
水
A.4 0.01 mol/L PBS(pH7.2～7.4)
Na₂HPO₄
NaH₂PO₄
NaCl
水
充分搅拌溶解后，4℃保存。
A.5 洗涤液 PBST(0.01 mol/L pH=7.4
磷酸盐缓冲液，含0.05%的Tween-20)
NaCl
Na₂HPO₄ · 12H₂O
KH₂PO
KCl
水
1000
mL
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Tween 20 0.5 mL
充分搅拌溶解后，4℃保存(可以配制10倍浓缩液存储)。
A.6 TMB 储存液
TMB(TMB 硫酸盐) 250 mg
DMF(N,N-Dimethylformamide 5 mL/瓶)25 mL
A.7 底物缓冲液(pH 5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液)
柠檬酸(C₆H₈O₇ ·H₂O) 1.02 g
Na₂HPO₄ · 12 H₂O 3.68 g
蒸馏水 100 mL
A.8 底物(临用时新鲜配制)
底物缓冲液 10 mL
TMB 储存液 0.1 mL
30%H₂O₂ 4μL～5μL
A.9 终止液
A.10 蛋白酶 K 缓冲液
用水配制，各成分为：50 mmol/L KCl,15 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)和0.5%
Nonidet P-40。 使用 前加入0.5 mg/mL 蛋白酶 K。
A.11 5×TBE 电泳缓冲液(5倍浓缩液)
Tris
硼酸
EDTA
水
用5 moL/L 的 HCl 调到 pH8.0。
A.12 EB (核酸染色剂)
用水配制成10 mg/mL 的浓缩液。用时每10 mL 电泳液或琼脂中加1μL。
A.13 样品缓冲液
每100 mL 水溶液中含：溴酚蓝0.25 g,蔗糖40 g。
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(资料性附录)
扩增产物的参考序列
B.1 内控 DNA 的参考序列(186 bp)
其中带下划线的基因片断为扩增引物
I TCATCCGAAT CCGACAACTG AGCCGTCTGT CGTATCCAGC TGCAAACTTC
CAGACAACGT
61 GCAACATCAG CTATATCGCG ACGTATCGTG ATATGGTTTT ACATAAACGA TGCACGTTTG
121 GCATGGTTGT CGTCTCTAGG TATCTTGAAC CCACTAGGTA TAGTGTGGGT
TTCTCCGCGA 181 TCTTGG
B.2 CCV 扩增产物的参考序列(136 bp)
其中带下划线的基因片断为扩增引物
1 TCATCCGAAT CCGACAACTG ACGCGTCGGT AGCCCGACCG ATCCGTATGT
TACGGGTGCG
61 GGGGTCGACA CCGTGCTCGC CGCGATGAGG CTGACCGCGG ACACGGGGGG TCCCCCTCGT
121 TTCTCCGCGA TCTTGC
参考序列来源：OIE
《水生动物疾病诊断手册》(2006版)第2.1.6章：斑点叉尾鲷病毒病。
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(资料性附录)
斑点叉尾細病毒病(CCVD)
C.1 疾病描述
斑点叉尾卿病毒病发现于美国地区，由斑点叉尾細病毒感染斑点叉尾蛔等温水鱼而引起的病毒性
疾病，死亡率可达100%。该病曾被世界动物卫生组织(OIE)
水生动物疾病诊断手册(2006)列为必须申
报的疫病，我国农业部公布的“一、二、三类动物疫病病种名录”将其列为二类动物疫病。
C.2 宿主
近几年报道的自然暴发该病仅仅限于斑点叉尾鲷(Ictalurus
punctatus)的鱼苗和鱼种。也有研究
结果证明，CCV 还能感染南方大口鲇和加州鲈，并能造成感染鱼的迅速死亡。
C.3 流行水温
该病在夏季水温25℃以上时会发病，流行适温为28℃~30℃,会出现斑点叉尾鲫鱼苗大量死亡。
在28℃时14天内死亡率达94%,19℃时仅14%。人工感染鱼苗，水温25℃~35℃,在一星期内出现
症状；水温低，则症状出现较慢。
C.4 临床症状
病鱼表现为摄食活动减弱，痉挛式旋转游动，头上尾下悬挂于养殖池边缘，最后沉入水底衰竭而亡。
病鱼皮肤及鳍条基部出血，腹部膨大，腹水增多，呈现淡黄色；鳃丝苍白或出血，眼球突出。内脏病变包
括：肾苍白肿大，肌肉、肝、肾、脾出血，肝、肾、脾肿大，胃内充满黏液样分泌物，腹膜水肿，腹腔内充满黄
色渗出物。
C.5 组织病理学
组织病理变化主要表现为：肾脏、肝脏肿大，脾脏充血，胃肠道水肿；造血组织和胃肠道内出现巨噬
细胞聚集区；有些肠壁的粘膜、粘膜下层发生坏死、脱落；有些鱼的肠粘膜下层及绒毛严重出血，甚至血
漏入肠腔；骨骼肌出血，胰脏坏死，神经细胞核出现空泡，周围神经纤维肿大。
C.6 病原
病原为斑点叉尾鲰病毒(CCV)。 病毒为20面体双链 DNA
病毒，有囊膜。病毒粒子直径175 nm~ 200 nm。
病毒只一种血清型，但采用单克隆抗体发现不同株间有不同抗原决定簇，并存在毒力的差异
和基因序列的差异。 CCV 仅能在BB、CCO、KIK
细胞株上复制生长，最适温度为25℃~30℃。
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CCV 对乙醚、氯仿、酸、热敏感，在甘油中失去侵染力；
-20℃冷冻后解冻3次，每次将失去%～%
侵染力，因此必须用新鲜组织分离病毒；病毒在含有10%血清，pH
为7.6～8.0培养液中， -75 ℃以下
保存时间最长。25℃时病毒在池水中能生存2天，在曝过气的自来水中生活11天；4℃时病毒在池水
中能存活近1个月，在曝过气的自来水中近2个月；病毒在池底淤泥中迅速失活。
斑点叉尾蛔成鱼带有的 CCV
是传染源，感染途径尚不清楚。水平传播主要来自罹病的濒死鱼
(moribund diseased fish)排出的病毒。
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